GLI INTERVENTI

Luigi Campanella
Preside della Facoltà di Scienze Matematiche e Fisiche dell’Università La sapienza di Roma, vincitore del premio per la Creatività Scientifica dell’Accademia delle Scienze Russa nel 1994 e da poco membro della stessa, Presidente del Polo Museale Università La Sapienza di Roma e past president della Società Chimica Italiana. Vincitore del premio “Pietro Croce per l’abolizione della sperimentazione animale” promosso da Equivita nel 2008

 

“Metodi innovativi per soddisfare la direttiva europea delle 3 R”

La sperimentazione animale è oggi sotto accusa ancorché ancora riconosciuta e limitatamente anche adottata. L’atteggiamento deriva da considerazioni di tipo diverso. Innanzitutto le conclusioni a cui giunge la sperimentazione animale non sempre sono trasferibili all’uomo, secondariamente il sacrificio di animali non trova un’accettabile giustificazione nei vantaggi che da esso possano derivare al genere umano, infine molte delle reazioni che avvengono in vivo, essendo ormai perfettamente conosciute, possono essere con successo riprodotte in vitro.

La chimica può fare molto per individuare test alternativi basati sullo studio delle interazioni fra molecole aggressive e ricettori. Anche la sensoristica è un campo dal quale possa derivare un sensibile e significativo contributo al superamento del test  con animali. Non solo però la chimica può favorire il superamento dei test su animali: la tassogenomica, la  enzimologia, la fisiologia hanno studiato e messo a punto test alternativi alla sperimentazione animale.

 

Tossicologia e Chimica

Il principio base della tossicologia fu enunciato da Paracelso nel 1538: tutto è tossico e tutto non lo è, dipende dalla dose; in altre parole è il livello di esposizione a una sostanza a stabilire se essa è poi tossica oppure no. Diventa quindi fondamentale abbinare ad ogni composto un valore di dose di tossicità. La tossicologia studia gli effetti dei vari composti sull'ecosistema quando quindi sono presenti ad una dose (livello di concentrazione) superiore a quella di nessun effetto.

Le discipline che necessariamente si correlano con la tossicologia sono la farmacologia, la fisiologia, la medicina del lavoro, la chimica, la genetica molecolare. La tossicologia contribuisce ad interpretare i livelli informativi che derivano dall'epidemologia, dalla bioanalisi, dalla scienza della sicurezza. I dati tossicologici sono già oggi importanti; lo saranno molto di più una volta che il regolamento REACH (Registration, Evaluation, Authorisation of Chemicals) sarà diventata legge europea.

Con riferimento a particolari matrici sono attive regolamentazioni integrative. Ad esempio nel caso del suolo la buona pratica di laboratorio suggerisce sia gli standard di riferimento con cui confrontarsi per concludere sulla tossicità o meno di composti presenti nel suolo sia i protocolli sperimentali di analisi. Lo sviluppo della scienza del suolo, in particolare della chimica del suolo, obbliga a rinnovare continuamente, a seguito degli avanzamenti della ricerca, questi standard e questi metodi. Ovviamente le innovazioni richiedono accreditamenti ripetuti (validazioni ufficiali, ring test).

Gli studi tossicologici su sistemi bersaglio sono generalmente condotti utilizzando differenti dosi di tossico capaci di coprire un largo intervallo di concentrazione. I risultati di ogni studio mostreranno generalmente, ma non sempre, effetti dannosi ad alte dosi, ed effetti lievi a basse dosi. Se la sostanza è tossica sarà così identificata la dose alla quale gli effetti dannosi compaiono (livello di effetto EL). La natura e la severità degli effetti osservati varierà con il tipo di test, il tempo di esposizione, la specie bersaglio il che mette in discussione qualunque trasferimento conclusivo da una specie ad un'altra. Lo studio identificherà anche la dose massima alla quale non si osservano effetti (livello di nessun effetto osservato NOEL). Così da studi di tossicità condotti in modo diverso potranno risultare differenti valori di NOEL: la valutazione del rischio dovrebbe basarsi sullo studio più sensibile che fornisce il minimo valore di NOEL. Qualche volta il termine NOEL è sostituito da NOAEL dove la lettera A sta per avverso, indicando con essa il carattere dell'effetto, rispetto ad un effetto non nocivo.

I risultati di studi di tossicità possono essere usati in due modi diversi: per predire livelli sicuri di esposizione dell'uomo e per predire livelli potenzialmente tossici e la natura probabile degli effetti dannosi.

Nel primo caso i risultati degli studi di tossicità possono essere usati per predire la più elevata quantità di un tossico assorbito su base giornaliera da un essere umano senza alcun danno sostanziale. Talvolta tale quantità viene riferita all'unità di peso del soggetto e viene assunta come pari al NOEL diviso per 100: ciò al fine di una maggiore garanzia a protezione degli esposti, tenuto conto che gli esseri umani possono essere più sensibili ai tossici degli animali utilizzati nei test di tossicità a causa di differenze tossicocinetiche e tossicodinaniche  nell'iter di un tossico (adsorbimento, metabolizzazione, escrezione per la tossicocinetica, attività contro la cellula, i tessuti, gli organi per la tossicodinamica).

Nel secondo caso i risultati degli studi della tossicità possono essere usati per predire la natura di effetti nocivi che si possono registrare negli esseri umani ed a quali livelli di esposizione tali danni si possano registrare. Molti tipi di effetto nocivo per un particolare tossico si osservano soltanto al di sopra di una certa dose, il cui valore però può variare al variare della specie e della durata dell'esposizione.

Per la maggior parte degli effetti tossici prodotti da un particolare composto c'è un valore di esposizione al di sotto del quale gli effetti nocivi non si osservano. A basse esposizioni il corpo può tollerare alcuni disturbi alle sue funzioni biochimiche e fisiologiche senza alcun segnale o sintomo di malattia. Talora l'organismo è capace di rimediare ad alcuni danni derivati dal contatto con alcuni composti purché questo sia limitato nel tempo, talaltra tale risanamento non può avvenire, il che si traduce in danno permanente e lunghe malattie. Quando i danni sono di natura genetica al DNA ed ai cromosomi o peggio portano a forme di cancro per danneggiamento del DNA si parla di effetti genotossici o carcinogenici. Questi effetti possono essere rilevati mediante test in vitro, ad esempio esponendo batteri ai tossici da testare (test di Ames) o cellule isolate animali o umane al tossico stesso. Se risultano effetti genotossici in vitro, si passa ai test in vivo su animali per confermare o meno i risultati in vitro. Il danno al DNA è un evento di tutti i giorni (si pensi all'esposizione alla componente ultravioletta dello spettro solare, all'esposizione ai radicali liberi dell'ossigeno, alla divisione cellulare) cosicché il nostro organismo deve porvi rimedio con provvedimenti ed iniziative che si ripetono per milioni di volte al giorno. Questi studi hanno dimostrato che danni al DNA possono prodursi anche a dosi molto basse, crescendo ovviamente nettamente al crescere della dose. Questi campioni vengono definiti positivi, nel senso che producono danno genotossico. Ad oggi non è possibile definire livelli di nessun effetto per i composti chimici positivi. I danni non riparati a cellule e DNA possono avere due conseguenze negative possono provocare divisione e mutazione cellulare. I danni al DNA non necessariamente devono portare a mutazioni cellulari. Gli effetti cancerogenici vengono osservati e misurati esponendo animali, generalmente topi o ratti di età giovane a dosi giornaliere di tossico esaminando il numero ed il tipo di tumori che si sviluppano ma le conclusioni di tale tipo di approccio soffrono di accuratezza in quanto riferite a specie diverse da quella che si intende proteggere, l'uomo. C'è infine da osservare che l'esposizione a dosi quanto si voglia piccole, se anche non produce alcun effetto nel tempo breve di fatto lo produce certamente nel lungo, lunghissimo tempo; questo tipo di rilevazione per motivi pratici non è di reale esecuzione. Per i composti cancerogenici differenti approcci ci dicono se ci sia un reale rischio di cancro ai valori di esposizione che realisticamente possono essere del tipo di quelli incontrati dagli esseri umani. Tali approcci si basano usualmente su curve dose/risposta, ottenute durante test animali. Queste curve relazionano l'incidenza del cancro alle variabilità delle dosi giornaliere assunte per tutta la vita.

Una varietà di modelli matematici può essere applicata alla curva dose-risposta per arrivare ad una stima del rischio. I modelli matematici sono generalmente considerati conservativi, fornendo una stima del rischio che non soltanto eccede sul fronte della sicurezza, ma può considerevolmente sovrastimare il rischio probabile per gli esseri umani. A causa delle limitazioni nei test sperimentali di cancerogenità animale e nei modelli, alcuni responsabili del rischio non vedono nell'approccio in precedenza indicato un'appropriata via per la stima del rischio umano. Se un composto si rivela genotossico tali responsabili possono decidere che l'esposizione degli esseri umani ad esso dovrebbe essere bassa quanto ragionevolmente prevedibile. Misure adeguate devono essere assunte per ridurre o eliminare l'esposizione. È evidente che i limiti fissati su tali basi possono implicare rischi diversi per sostanze di differente attività.

 

Descrittori Molecolari

La struttura molecolare condiziona molte delle proprietà di un composto e quindi le sue possibili applicazioni in numerosi campi. Per definizione un sistema è complesso quando il suo comportamento non è derivabile dalle proprietà delle sue singole parti esattamente quanto avviene ad una molecola che quindi per definizione è un sistema complesso: le sue proprietà dipendono dagli atomi costituenti e dalle loro interazioni. La rappresentazione di una molecola può avvenire secondo approcci differenti (tridimensionale, bidimensionale, vettoriale). I descrittori molecolari sono numeri capaci di estrarre da ogni rappresentazione frazioni di informazione chimica.

Tali descrittori consentono di stabilire relazioni quantitative tra le strutture, le proprietà, le attività biologiche. Pertanto tali descrittori giuocano un ruolo molto importante nella ricerca scientifica. Ne sono stati proposti più di 2000 ed il numero è continuamente crescente; vengono usati nella modellistica molecolare correlati con le scienze statistiche e chemiometriche, ed in questo rappresentano una vera e propria rivoluzione tenuto conto che fino a 30 anni fa la modellistica molecolare consisteva nella ricerca di relazioni matematiche fra grandezze misurate sperimentalmente. Per spiegare le complesse relazioni fra molecole e grandezze misurate sono applicati due approcci fondamentali: QSAR (Quantitative Structure Activity Relationship) che ricerca correlazioni fra struttura molecolare ed attività biologica e QSPR (Quantitative Structure Property Relationship) che ricerca correlazioni fra struttura molecolare e proprietà chimico-fisiche.

In futuro è da prevedere che molte proprietà saranno descritte piuttosto che misurate, ma questo non toglierà mai valore all'esperienza che sarà chiamata a confermare i valori prodotti e soprattutto a correggere i modelli molecolari applicati se risultati errati.

Descrittori comuni

Proprietà chimico fisiche

punto di ebollizione

punto di fusione

punto di sublimazione

solubilità

tensione di vapore

volume molecolare

 

Attività biologica

Mutogenicità

Carcinogenità

Dose letale

Concentrazioni di inibizione

Attività farmacologiche

 

Proprietà Ambientali

Biodegradabilità

Bioaccumulo

Tempo di dimezzamento

Mobilità

Persistenza Ambientale

COD/BOD

     

Il regolamento REACH che di certo rappresenta un importante passo in avanti nella direzione di garantire la sicurezza dei consumatori e cittadini prevede ancora l’uso dei test su animali, ma contemporaneamente l’UE chiede alla comunità scientifica uno sforzo per provvedere in prospettiva alla completa rinuncia ad essi ed ha rivisto la direttiva che regola la protezione degli animali usati per scopi scientifici e sperimentali. La Direttiva 86/609/EEC che data al 1986 ha il fine di standardizzare il buono stato (il benessere) degli animali nei laboratori di ricerca in Europa. In Marzo 2009 la Commissione sull’Agricoltura e lo Sviluppo Rurale del Parlamento Europeo ha votato 524 emendamenti a questa direttiva, di questi 161 sono stati adottati. Con le sue decisioni la Commissione ha inteso limitare la sperimentazione senza con questo bloccare la ricerca scientifica. I Membri del Parlamento Europeo hanno votato per regole che dovrebbero assicurare che i test programmati siano assoggettati a cogenti valutazioni etiche per tenere conto della posizione dei cittadini. L'impiego di animali nelle procedure scientifiche dovrebbe essere considerato soltanto in ) di mancanza di un'alternativa.

Circa a 12 milioni di animali vengono impiegati per scopi scientifici in Unione Europea ogni anno. Circa 10000 di questi sono primati non umani. Due terzi di questi sono impiegati per valutare sicurezza ed efficacia di farmaci e dispositivi farmaceutici. Il rimanente terzo è impiegato per studi biologici di base e per ricerche in medicina umana e veterinaria. Con le sue decisioni recenti il Parlamento Europeo ha bandito l'impiego di grandi primati non umani (scimpanzé, gorilla, orango) eccetto che per esperimenti finalizzati proprio alla conservazione di queste specie. Tale tipo di sperimentazione è già vietata in Austria, Gran Bretagna, Olanda, Svezia e di fatto in Europa non avviene più dal 2002: pertanto il bando non influenza significativamente la ricerca attuale. Il Parlamento Europeo ha anche deciso che i test su animali diversi dai primati non umani non dovrebbero essere ristretti a condizioni che minaccino o disabilitino alla vita. Questo leggerebbe seriamente la ricerca su alcune forme di cancro, sclerosi multipla e morbo di Alzheimer. Inoltre le linee guida europee ed internazionali richiedono che alcuni farmaci siano testati sui primati prima di essere approvati, da cui la necessità in alcuni casi di approvazione di questi test, posizione che sostanzialmente è stata sostenuta da molti scienziati dell'industria farmaceutica e dalle associazioni di ricerca medica ed accettata dal Parlamento Europeo.